(一)、ABC法：(注，下面各種方法，均為手工操作，如沒特別說明，均在室溫下進行)

1.切片經二甲苯Ⅰ 5分鐘。

2.切片經二甲苯Ⅱ 5分鐘。

3. *Ⅰ 30秒。

4. *Ⅱ 30秒。

5. 95%酒精Ⅰ 30秒。

6. 95%酒精Ⅱ 30秒。

7. 90%酒精 30秒。

8.80%酒精 30秒。

9. 70%酒精 30秒。

10.自來水洗。(后面的切片脫蠟至水一般都是1-10)

11.0.3%H2O2甲醇處理切片10-20分鐘。

12.水洗。

13.抗原修復。

14.PBS洗3次，1分鐘/次。

15.加入血清孵育20分鐘。

16.摔干血清，加入一抗60分鐘。

17.PBS洗3次，2分鐘/次。

18.加入二抗孵育30分鐘。

19.PBS洗3次，2分鐘/次。

20.加入ABC復合物，孵育30分鐘。

21. PBS洗3次，2分鐘/次。

22.DAB-H2O2孵育切片5-10分鐘。

23.PBS洗，水洗。

24.Harris蘇木素染核5-10分鐘。

25.水洗，分化，藍化，脫水，透明并封固。

(二)、LSAB法。(SP法)(Labelled streptavidim biotln)

1.切片脫蠟至水。

2.0.3%H2O2甲醇處理切片10-20分鐘。

3.水洗。

4.抗原修復。

5.PBS洗3次，1分鐘/次。

6.加入血清孵育10分鐘。

7.摔去血清，加入一抗孵育30-60分鐘。

8.PBS洗3次，每次2分鐘。加入二抗，孵育20分鐘。

9.PBS洗3次，每次2分鐘。

10.加入SP復合物孵育20-30分鐘。

11.PBS洗3次，每次2分鐘。

12.DAB-H2O2孵育5-10分鐘。

13.PBS洗，水洗。

14.Harris蘇木素染核5-10分鐘。

15.水洗，分化 ，藍化，脫水，透明并封固。

(三)真空負壓LSAB法

1.切片脫蠟至水。

2. 0.3%H2O2甲醇真空負壓處理5min.

3. 水洗。

4.如果需要，可進行抗原修復。

5.PBS洗3次，每次1分鐘。

6.加入正常血清真空負壓處理5min。

7.摔干血清，加入*抗體，真空負壓處理5分鐘。

8. PBS洗3次，每次2分鐘。

9. 加入二抗(即連接抗體)真空負壓處理5分鐘。

10.PBS洗3次，每次2分鐘。

11.加入鏈卵蛋白復合物，真空負壓處理 5分鐘。

12.PBS洗3次，每次2分鐘。

13.DAB-H2O2孵育5-10分鐘。

14.PBS洗，水洗。

15.染核，分化，藍化，脫水，透明并封固。

注：真空負壓即將真空干燥中抽成真空。負壓達66.7KPa(500mmHg)

(四)Envision TM Systems.

1.切片脫蠟至水。

2.0.3%H2O2甲醇處理切片10分鐘。

3.水洗。

4.抗原修復。

5.PBS洗3次，每次1分鐘。

6.加入一抗體孵育30-60分鐘。

7.PBS洗3次，每次2分鐘。

8.加入增強劑孵育20-30分鐘。

9.PBS洗3次，每次2分鐘。

10.加入酶標抗兔/鼠，復合物，孵育20-30分鐘。

11.PBS洗3次，每次2分鐘。

12.DAB-H2O2孵育5-10分鐘。

13.PBS洗，水洗。

14.Harris蘇木素染核5-10分鐘。

15.水洗，分化，藍化，脫水，透明并封固。

(五)免疫組化雙染色法。(ⅰ) (Ionmuno-Histochemistry double staimimg method)

1.切片脫蠟至水。

2.0.3%H2O2甲醇處理切片10分鐘。

3.水洗。

4.抗原修復。

5.PBS洗3次，每次1分鐘。

6.加入非免疫性動物血清，孵育10分鐘。

7.PBS洗3次，每次2分鐘。

8.加入*抗體孵育60分鐘。

9.PBS洗3次，每次2分鐘。

10.加入生物素化的第二抗體，孵育10分鐘。

11.PBS洗3次，每次2分鐘。

12.加入鏈卵蛋白素過氧化物酶孵育10分鐘。

13.PBS洗3次，每次2分鐘。

14.加入DAB-H2O2孵育5-10分鐘。

15.PBS洗3次，每次2分鐘。

16. 加入雙染增強液，孵育10分鐘。

17. 加入非免疫性動物血清孵育10分鐘。

18. PBS洗3次，每次2分鐘。

19. 加入選用的第二種抗體孵育60分鐘。

20. PBS洗3次，每次2分鐘。

21. 加入生物素標記的第二抗體孵育10分鐘。

22. PBS洗3次，每次2 分鐘。

23. 加入鏈卵蛋白素堿性磷酸酶孵育10分鐘。

24. PBS洗3次，每次2分鐘。

25. 加入AEC溶液，孵育5-10分鐘。

26. 自來水洗。

27. 蘇木素染核5-10分鐘。

28. 水性封片。

注：1.*種復合物也可先用鏈卵蛋白素堿性磷酸酶。

2.第1次顯色也可用BCIP/NBT溶液，顏色為藍黑色，但應與蘇木素鑒別。

(六)、免疫組化的雙染色法(ⅱ) (Immuno-histochemistry double staining method)

1.切片脫蠟至水。

2.0.3%H2O2甲醇處理切片10分鐘。

3.水洗。

4.抗原修復。

5.PBS洗3次，每次1分鐘。

6.加入選用的*抗體孵育30-60分鐘。

7.PBS洗3次，每次2分鐘。

8.加入增強劑孵育20-30分鐘。

9.PBS洗3次，每次2分鐘。

10.加入酶標抗兔/鼠，復合物，孵育

11.PBS洗3次，每次2分鐘。

12.加入DAB-H2O2孵育5-10分鐘

13.PBS洗3次，每次2分鐘。

14.加入選用的第二種抗體孵育60分鐘。

15.PBS洗3次，每次2分鐘。

16. 加入增強劑孵育20-30分鐘。

17. PBS洗3次，每次2分鐘。

18. 加入酶標抗兔/鼠堿性磷酸酶復合物孵育20-30分鐘。

19.PBS洗3次，每次2分鐘。

20.加入AEC溶液孵育5-10分鐘。

21.自來水洗。

22.蘇木素染核5-10分鐘。

23.水性封片。

(七)細胞培養(yǎng)片免疫熒光染色法。

1.將細胞于載片或蓋玻片的片子用生理鹽水洗幾次。

2.純丙酮固定10分鐘。

3.PBS浸洗3次，每次1分鐘。

4.加入選用的*抗體孵育120分鐘。

5.PBS洗3次，每次2分鐘。

6.加入熒光抗體孵育60分鐘以上。

7.PBS法3次，每次2分鐘。

8.0.1%伊文氏藍襯染3分鐘。

9.水洗，蒸餾水洗。

10. 水性膠封片或用緩沖甘油封片。

(八)真空負壓免疫熒光染色法染細胞培養(yǎng)片。

1. 將細胞爬于載玻片或蓋玻片的片子用生理鹽水浸洗數(shù)次，*洗去蛋白液。

2.純丙酮固定5-10分鐘。

3.PBS浸洗3次，每次1分鐘。

4.加入選用的*抗體孵育真空負壓處理15分鐘。

5.PBS洗3次，每次2分鐘。

6.加入熒光抗體孵育真空負壓處理15分鐘。

7.PBS洗3次，每次2分鐘。

8.0.1%伊文氏藍襯染3分鐘。

9.水洗，蒸餾水洗。

10.水性膠封片或用緩沖甘油封片。