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雙縮脲法蛋白含量檢測(cè)試劑盒的操作步驟!

更新時(shí)間:2018-01-02      瀏覽次數(shù):1802

雙縮脲法蛋白含量檢測(cè)試劑盒的操作步驟!

注意:

正式測(cè)定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定,確保蛋白濃度在 1~ 10mg/ml 范圍內(nèi)。

測(cè)定意義:

樣品可溶性蛋白質(zhì)含量常常用于酶活性計(jì)算。此外,可溶性蛋白質(zhì)含量也用于食品等質(zhì)量分 析。

測(cè)定原理:

強(qiáng)堿性溶液中,雙縮脲與 CuSO4 形成紫色絡(luò)合物;紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成 正比,而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無(wú)關(guān),故可用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)含量。

該方法測(cè)定范圍為 1~10mg 蛋白質(zhì),適用于蛋白質(zhì)濃度高的樣品,尤其是動(dòng)物材料。

自備儀器和用品:

離心機(jī)、可見(jiàn)分光光度計(jì)、移液器、1 mL 玻璃比色皿和蒸餾水。

試劑組成和配制

試劑一:液體×1 瓶,4℃保存。

標(biāo)準(zhǔn)品:液體×1 瓶,5 mg/mL,4℃保存。

樣品中可溶性蛋白質(zhì)提取

1. 液體樣品:澄清無(wú)色液體樣品可以直接測(cè)定。

2. 組織樣品:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議稱取約 0.1g 組織,加入 1mL 提取液(自備,根據(jù)需要選用酶提取緩沖液或者蒸餾水或者生理鹽水)) 冰浴勻漿,8000g,4℃離心 10min,取上清,即待測(cè)液。(動(dòng)物樣品常常需要稀釋)

3. 細(xì)菌、真菌:按照細(xì)胞數(shù)量(104 個(gè)):提取液體積(mL)為 500~1000:1 的比例(建 議 500 萬(wàn)細(xì)胞加入 1mL 提取液),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率 300w,超聲 3 秒,間隔 7 秒,總時(shí)間 3min);然后 8000g,4℃,離心 10min,取上清置于冰上待測(cè)。

雙縮脲法蛋白含量檢測(cè)試劑盒的操作步驟!

測(cè)定操作

1. 分光光度計(jì)預(yù)熱 30 min,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 540 nm,蒸餾水調(diào)零。

2. 空白管:取 1 mL 玻璃比色皿,加入 200μL 蒸餾水,1000μL 試劑一,混勻后室溫靜置 15 min,于 540nm 比色,記為 A 空白管。

3. 標(biāo)準(zhǔn)管:取 1 mL 玻璃比色皿,加入 200μL 標(biāo)準(zhǔn)液,1000μL 試劑一,混勻后室溫靜置 15 min,于 540 nm 比色,記為 A 標(biāo)準(zhǔn)管。

4. 測(cè)定管:取 1 mL 玻璃比色皿,加入 200μL 待測(cè)液,1000μL 試劑一,混勻后室溫靜置 15 min,于 540nm 比色,記為 A 測(cè)定管。

注意:

空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需測(cè)定一次。 樣品中蛋白質(zhì)濃度計(jì)算公式 C 待測(cè)(mg/mL)= C 標(biāo)準(zhǔn)管×(A 測(cè)定管-A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管) =5×(A 測(cè)定管-A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)

注意事項(xiàng):

1.樣品蛋白濃度須在 1~10mg/ml 范圍內(nèi),低于 1mg/ml 不能用此法,高于 10mg/ml 須做相應(yīng) 稀釋。因此測(cè)定前用 1~2 個(gè)樣做預(yù)實(shí)驗(yàn),確保蛋白濃度在 1~10mg/ml 范圍內(nèi)。

2.待測(cè)樣品蛋白提取可用生理鹽水、雙蒸水或不含蛋白的 PBS 提取。該法受硫酸銨、Tris 緩 沖液干擾,提取液中應(yīng)不含這些物質(zhì);否則改用 BCA 蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒。

雙縮脲法蛋白含量檢測(cè)試劑盒的操作步驟!

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