99E久热只有精品8在线直播-国语自产少妇精品视频-中文字幕人妻色偷偷久久-来一水AV@lysav

熱門搜索: 肌酸激酶MB型同工酶(CK-MM)質(zhì)控樣品 抗血漿鑒別試劑盒 甲種胎兒球蛋白抗原 重組核心鏈霉親和素 2(不帶標(biāo)簽) 重組鏈霉親和素(r-ScSA)(NC膜專用) 重組鏈霉親和素(帶His標(biāo)簽) 羊抗人視-黃醇結(jié)合蛋白多克隆抗體 大鼠白細(xì)胞介素1β(IL-1β)試劑盒(ELISA) 人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子ELISA試劑盒 1%豚鼠紅細(xì)胞 2%雞紅細(xì)胞 1%雞紅細(xì)胞 重組人線粒體核糖體蛋白S2(MRPS2) 重組人蛋白酶體激活物亞基1(PSME1)蛋白 重組人肝癌衍生生長(zhǎng)因子相關(guān)蛋白3 重組人FAM83A蛋白

PRODUCT CLASSIFICATION

產(chǎn)品分類

技術(shù)文章/ Technical Articles

您的位置:首頁(yè)  /  技術(shù)文章  /  蛋白實(shí)驗(yàn)中常見的問題

蛋白實(shí)驗(yàn)中常見的問題

更新時(shí)間:2019-03-29      瀏覽次數(shù):4680

1、蛋白樣品不能反復(fù)凍融;

2、蛋白樣品應(yīng)加蛋白酶抑制劑,以增加蛋白的穩(wěn)定性;

3、細(xì)胞水平要做 Western Blot,一般地 5×106 個(gè)細(xì)胞提取的蛋白夠就足 Western Blot;

4、如果目標(biāo)蛋白是膜蛋白和胞漿蛋白,所用的去垢劑就要溫和得多,建議提取后hao加上 NaF 去抑制磷酸化酶的活性;

5、若轉(zhuǎn)膜不*,可以加大上樣量,還有轉(zhuǎn)移時(shí)你可以用降低電流延長(zhǎng)時(shí)間,轉(zhuǎn)膜液中甲醇的比例多加 510%;

6、如果上樣量超載,可以濃縮樣品,也可以根據(jù)你的目標(biāo)分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地,超載 30%是不會(huì)有問題的。如果已經(jīng)超了不少了,而且小分子量的也要,可以考慮加大膠的厚度,可以試試 1.5mm comb;

7、蛋白變性后,-80,一兩年沒有問題。關(guān)鍵兩條:不要被蛋白酶水解掉;不要被細(xì)菌消化掉(也是被酶水解了);

8、脫脂奶粉中含生物素,如果實(shí)驗(yàn)中有涉及到生物素請(qǐng)將封閉液改為 BSA 封閉;

9、做 200kd 以上蛋白的 Western Blot 時(shí)要注意,分離膠hao選擇>7%的;剝膠時(shí)要小心;轉(zhuǎn)移時(shí)間需要相應(yīng)延長(zhǎng);要做分子量參照(否則出現(xiàn)雜帶不知道如何分析);

10、蛋白的上樣量要根據(jù)實(shí)驗(yàn)的要求來(lái)定,如果要求是定量和半定量的 Western Blot 則上樣量要均等,如果只是要定性,則沒有太大的關(guān)系,盡量多上就行了,但是不要超過 0.3μg/mm2;

11、一抗,二抗的比例是比較重要,調(diào)整好一抗,二抗的比例,可以去掉部分非特異的本底;

12、免疫組化和 Western Blot 可以用同一種抗體嗎?

免疫組化時(shí)抗體識(shí)別的是未經(jīng)變性處理的抗原決定簇(又稱表位),有些表位是線性的,而有的屬于構(gòu)象型;線性表位不受蛋白變性的影響,天然蛋白和煮后的蛋白都含有;構(gòu)象型表位由于受蛋白空間結(jié)構(gòu)限制,煮后變性會(huì)消失。如果你所用的抗體識(shí)別的是蛋白上連續(xù)的幾個(gè)氨基酸,也就是線性表位,那么這種抗體可同時(shí)用于免疫組化和 Western,而如果抗體識(shí)別構(gòu)象形表位,則只能用于免疫組化。一般抗體說明書上都有注明此種抗體識(shí)別的氨基酸區(qū)間。(限于單抗);

13、抗體工作溶液一般不主張儲(chǔ)存反復(fù)使用,但是如抗體比較珍貴,可反復(fù)使用 23 次。稀釋后應(yīng)在 23 天內(nèi)使用,4 度保存,避免反復(fù)凍融;

14、NC PVDF 膜 尼龍膜的差異。

尼龍膜是較理想的核酸固相支持物,有多種類型;硝酸纖維素膜是目前應(yīng)用zui廣的一種固相支持物,價(jià)格*;PVDF 膜介于二者之間。

就結(jié)合能力而言: 尼龍膜結(jié)合 DNA RNA 能力可達(dá) 480600μg/cm2,可結(jié)合短至 10bp 的核酸片段;硝酸纖維素膜結(jié)合 DNA RNA 能力可達(dá) 80100μg/cm2,對(duì)于 200bp 的核酸片段結(jié)合能力不強(qiáng);PVDF 膜結(jié)合 DNA RNA 能力可達(dá) 125300μg/cm2。

就溫度適應(yīng)性而言:尼龍膜經(jīng)烘烤或紫外線照射后,核酸中的部分嘧啶堿基可與膜上的正電荷結(jié)合;硝酸纖維素膜依靠疏水性相互作用結(jié)合 DNA,結(jié)合不牢固;PVDF 膜結(jié)合牢固,耐高溫,特別適合于蛋白印跡。

就韌性而言:尼龍膜較強(qiáng);硝酸纖維素膜較脆,易破碎;PVDF 膜較強(qiáng)。

就重復(fù)性而言:尼龍膜可反復(fù)用于分子雜交,雜交后,探針分子可經(jīng)堿變性被洗脫下來(lái);硝酸纖維素膜不能重復(fù)使用;PVDF 膜可以重復(fù)使用。

15、在做 Western Blot 時(shí),PVDF 膜用甲醇浸泡的目的。

PVDF 膜用甲醇泡的目的是為了活化 PVDF 膜上面的正電基團(tuán),使它更容易跟帶負(fù)電的蛋白質(zhì)結(jié)合,做小分子的蛋白轉(zhuǎn)移時(shí)多加甲醇也是這個(gè)目的。

16、膜、濾紙、膠大小有何講究?

如果用的是半干法,順序?yàn)椋宏帢O-濾紙-膠-膜-濾紙。濾紙的長(zhǎng)寬分別比膠面小 12mm,而膜的長(zhǎng)寬分別比膠大 12mm。

禁忌:上下兩層濾紙因?yàn)檫^大而相互接觸,這樣會(huì)短路,電流不會(huì)通過膠和濾紙。

17、電泳時(shí) Marker 總跑不全所有條帶,即使用增大膠濃度仍不全?

檢查兩種緩沖液 Tris-HClpH 8.8 pH 6.8),有可能有長(zhǎng)菌現(xiàn)現(xiàn)象,建議重配兩種緩沖液。

18Western Blot 染色的選擇

1)陰離子染料是zui常用的,特別是氨基黑,脫色快,背景低檢測(cè)極限可達(dá)到 1.5μg,考馬斯亮藍(lán)雖然與氨基黑有相同的靈敏度,但脫色慢,背景高。麗春紅 S 和快綠在檢測(cè)后容易從蛋白質(zhì)中除去 ,以便進(jìn)行隨后的氨基酸分析。

缺點(diǎn)是:溶劑系統(tǒng)的甲醇會(huì)引起硝化纖維素膜的皺縮或破壞。不能用于正電荷的膜。靈敏度低。

2)膠體金,靈敏度高,檢測(cè)范圍可到 pg 級(jí),但染色不穩(wěn)定。

3)生物素化靈敏度位于 1、2 之間,可用于任何一種膜。

19、轉(zhuǎn)膜液加甲醇的目的是什么?

加甲醇起著一定的固定作用,因?yàn)樾》肿拥鞍踪|(zhì)容易轉(zhuǎn)出去.(特別是在硝酸纖維素膜上,因?yàn)?/span> NC 膜結(jié)合蛋白質(zhì)的能力較弱)。

20、轉(zhuǎn)膜時(shí)何為濕法,何為半干法?

半干法和濕法轉(zhuǎn)移是兩種不同的轉(zhuǎn)移裝置下的轉(zhuǎn)移系統(tǒng),將膜,膠,濾紙整個(gè)浸泡在 buffer Tank 里轉(zhuǎn)移的,叫濕法;用濾紙吸 buffer 來(lái)做轉(zhuǎn)移體系的叫半干法。

21、為什么濃縮膠和分離膠的電壓不一致?同樣的電壓可以嗎?

濃縮膠的目的使得 loading 的樣品能夠在同一條水平線上進(jìn)入分離膠 ,如果電壓太大前端的蛋白容易在后面的蛋白趕上來(lái)前進(jìn)入分離膠。

而在分離的理論上(實(shí)際上也是)小電壓長(zhǎng)時(shí)間分離的效果會(huì)更好,但是在操作過程中沒有必要等那么長(zhǎng)的時(shí)間,所以就用大電壓快點(diǎn)跑。

微信掃一掃

郵箱:1170233632@qq.com

傳真:021-51870610

地址:上海市顧戴路2988號(hào)B幢7樓

Copyright © 2024 上海信帆生物科技有限公司版權(quán)所有   備案號(hào):滬ICP備13019554號(hào)-1    技術(shù)支持:化工儀器網(wǎng)

TEL:13764793648

掃碼加微信
色噜噜狠狠一区二区三区果冻| 亚洲AV乱码一区二区三区 | 国产又色又爽又黄又免费| 97久久精品人人做人人爽| 久久久国产精品免费A片分环卫| 亚洲AV无码国产一区二区三区| 亚洲无码一区二区三区| 中文无码人妻有码人妻中文字幕| 99国产精品99久久久久久| 亚洲无码一区二区三区| 亚洲AV日韩精品久久久久久久| 特级太黄A片免费播放一| 亚洲欧美国产精品专区久久| 亚婷婷洲AV久久蜜臀无码| 女人18毛片a级毛片免费视频| 少妇荡乳情欲办公室456视频| 国产精品久久毛片| 我的SM经历1一25章| 成人妇女免费播放久久久| 欧美乱熟人妻色情影视| 国产精品久久久久久无码不卡 | 熟女俱乐部五十路六十路AV | 中文字幕亚洲欧美日韩在线不卡| 少妇又紧又色又爽又刺激视频| 成人无码精品1区2区3区免费看| 水蜜桃AV无码| 亚洲AV无码一区二区乱子伦| 精品无码国产自产在线观看水浒传 | 妈妈的朋友在线| 色综合久久精品亚洲国产| 女人18毛片水真多| 妓女嫖客叫床粗话对白| 办公室撕开奶罩揉吮奶漫画| 国产精品视频一区二区噜噜 | 国产欧美精品一区二区三区| 国产精品无码一区二区三区| JZZIJZZIJ亚洲乱熟无码| 中国极品少妇XXXXX| 亚洲熟女综合色一区二区三区 | 人妻丰满熟妇AⅤ无码区| 久久性爱视频|