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甘油檢測(cè)試劑盒(組織,細(xì)胞)的原理

更新時(shí)間:2022-03-03      瀏覽次數(shù):1510

甘油檢測(cè)試劑盒(組織,細(xì)胞)的原理


上海信帆生物供應(yīng)的甘油檢測(cè)試劑盒檢測(cè)組織和細(xì)胞中甘油含量,除此之外我們還有專(zhuān)門(mén)檢測(cè)液體樣本中甘油含量的試劑盒供應(yīng)。

 

描述:甘油是甘油三酯的水解產(chǎn)物。與游離脂肪酸一樣,甘油含量是甘油三酯水解反應(yīng)的可靠檢測(cè)指標(biāo),但檢測(cè)更加方便。本試劑盒采用優(yōu)化步驟,能夠檢測(cè)實(shí)體組織、細(xì)胞中的甘油含量,線性范圍為10-1200µmol/L

 

原理:在 ATP 存在下甘油被甘油激酶磷酸化為 3-磷酸甘油,再被甘油磷酸氧化酶氧化產(chǎn)生過(guò)氧化

氫;在過(guò)氧化物酶作用下生色底物轉(zhuǎn)化為苯醌亞胺,其光密度值與甘油濃度成正比。

 

適用范圍:測(cè)定實(shí)體組織、細(xì)胞中的甘油濃度。組成 (105 次微板測(cè)定或 30 次 1 ml 比色杯測(cè)定):

(1) 裂解液 50 ml 

(2) R1 試劑 16 ml

(3) R2 試劑 4 ml 

(4) 4 mmol/L 甘油標(biāo)準(zhǔn)品 1 ml

4 oC,儲(chǔ)存 3 月。

所需設(shè)備:酶標(biāo)儀、生化分析儀或 721、722 型可

見(jiàn)光分光光度計(jì)。佳工作波長(zhǎng) 550nm,如無(wú)此波

長(zhǎng)建議優(yōu)先選用 570nm、次選 530、490nm。

一 組織細(xì)胞裂解 

細(xì)胞(包括分化的脂肪細(xì)胞)裂解: 消化、離心收集細(xì)胞?;蛑苯釉谂囵B(yǎng)皿內(nèi)裂解。通常6孔板單孔約2x106個(gè)細(xì)胞,75cm2瓶約1x107細(xì)胞。按比例每 1~2 x 106細(xì)胞加 0.1ml 裂解液,混勻,靜置 10 分鐘。

動(dòng)物組織裂解:

切記要預(yù)先將新鮮組織剪切稱(chēng)重后再進(jìn)行保存。組織凍存后再進(jìn)行解凍、剪切、稱(chēng)重可能會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的測(cè)量誤差。離心管精確稱(chēng)重,加入組織塊后再稱(chēng)重,二者相減(即減量稱(chēng)重法)計(jì)算組織量(約 100mg)。強(qiáng)烈建議按比例每 1mg 組織加10µl裂解液以減少樣品間蛋白和脂質(zhì)含量變異而產(chǎn)生的誤差。(注意;裂解液用量在 1ml 或更多可保證有效的裂解與脂質(zhì)提?。?。用電動(dòng)高速勻漿器或手動(dòng)玻璃勻漿器破碎組織。(不推薦超聲方法,因其不能*和均勻破碎。應(yīng)根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)調(diào)整初始的組織細(xì)胞加入量),而后,靜置 10 分鐘。

 

二. 裂解液處理: 

1. 取適量上清液轉(zhuǎn)移到 1.5ml 離心管中,進(jìn)行步驟

2 的操作。余下的裂解液可用 BCA 法蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量或-20oC 儲(chǔ)存。

2. 70oC 加熱 10 分鐘滅活脂肪酶,可能出現(xiàn)絮狀沉淀。

3. 室溫 5000rpm 離心 5 分鐘,上層清液即可用于酶學(xué)測(cè)定。

 

三 工作溶液配制:按 4:1 比例,取 4 ml 試劑 R1 與1 ml 試劑 R2 混合即可,立即使用或 4oC 保存<1 天,變色棄去。(注意:謹(jǐn)防來(lái)源不明但容易發(fā)生的甘油污染,可來(lái)自操作者本人或標(biāo)準(zhǔn)品液體微粒濺射等。)

 

四 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋?zhuān)河谜麴s水、生理鹽水或與樣品緩沖液*的液體,將 4 mM 甘油標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋為1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125µmol/L,通常取其中 4~6 管即可,注意設(shè)置 0 濃度對(duì)照反應(yīng)管。

五 甘油測(cè)定 

1. 參見(jiàn)下表加樣。待測(cè)樣品體積 10µl,多加可能會(huì)抑制反應(yīng)。

2. 37oC 或 25oC 反應(yīng) 10 分鐘。反應(yīng)平衡后顏色在60 分鐘內(nèi)穩(wěn)定。

3. 先用蒸餾水+工作液的空白管調(diào)零,然后測(cè)定各管 OD 值。

4. 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算甘油濃度。

附 Excel 作圖步驟:各標(biāo)準(zhǔn)管 OD 值為 y 軸,標(biāo)準(zhǔn)品濃度為 x 軸。(1)鼠標(biāo)左鍵圈住數(shù)據(jù),點(diǎn)擊做圖向?qū)Вx擇-散點(diǎn)圖-,點(diǎn)擊-完成-。(2)鼠標(biāo)右鍵點(diǎn)圖上的某一點(diǎn),點(diǎn)擊-添加趨勢(shì)線-,點(diǎn)擊-選項(xiàng)-,點(diǎn)擊-顯示公式-和-R2 值-。

5. 以每 mg 蛋白濃度或細(xì)胞數(shù)校正甘油含量。見(jiàn)說(shuō)明書(shū)

說(shuō)明: 

1.血紅蛋白>2g/L、膽紅素>0.25g/L、二硫蘇糖醇、巰基乙醇、高濃度EDTA干擾測(cè)試。

2.紅細(xì)胞糖酵解時(shí)合成磷酸甘油影響測(cè)定。

參考文獻(xiàn): 

1. Trinder, P. (1969). Ann. Clin. Biochem. 6: 24 – 27.

2. Barham D and Trinder P. (1972). Analyst 97: 142 – 145


甘油檢測(cè)試劑盒(組織,細(xì)胞)的原理

 

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