專(zhuān)業(yè)的RT-PCR實(shí)驗(yàn)代測(cè)服務(wù)商

服務(wù)內(nèi)容：

1.制定個(gè)性化實(shí)驗(yàn)方案：根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康拇_定實(shí)驗(yàn)方案、選定合適的內(nèi)參；
2.檢測(cè)類(lèi)別：mRNA、miRNA、lncRNA、DNA；
3.樣本抽提及質(zhì)檢：對(duì)客戶提供樣本進(jìn)行RNA抽提，并利用NanoDrop進(jìn)行樣本質(zhì)檢；
4.定量PCR預(yù)實(shí)驗(yàn)：包括樣本反轉(zhuǎn)錄為CDNA、配置PCR反應(yīng)體系及進(jìn)行Real-TimePCR反應(yīng)；
5.正式定量PCR實(shí)驗(yàn)：根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)；
6.數(shù)據(jù)分析：采用2- △△CT法進(jìn)行分析，比較不同樣本間差異。

服務(wù)要求：
1.請(qǐng)?zhí)峁┙M織樣本，細(xì)胞樣本，血漿或血清樣本，totalRNA；
2.請(qǐng)?zhí)峁┮阎娜L(zhǎng)基因序列或GeneBank號(hào)；
3.請(qǐng)?zhí)峁┍M可能詳細(xì)的背景資料：DNA/RNA來(lái)源、基因豐度等。

結(jié)果內(nèi)容：整理好的報(bào)告，樣本收到之日起5個(gè)工作日內(nèi)反饋質(zhì)檢結(jié)果。

結(jié)果展示：

樣本質(zhì)檢圖

溶解曲線：

擴(kuò)增曲線

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

每個(gè)指標(biāo)有2張圖。一張是擴(kuò)增曲線，另一張是熔解曲線，用來(lái)證明PCR擴(kuò)增中無(wú)非特異性擴(kuò)增

送樣運(yùn)輸要求：

1. 樣品處理

a. 動(dòng)物組織：常規(guī)組織，脂肪組織，結(jié)締組織，纖維化組織適當(dāng)增加。將組織剪切成合適大小后（建議組織塊長(zhǎng)寬高均不大于0.5 cm），然后迅速浸泡于5～10倍體積的RNAsolidTM試劑中。（注意：已浸入RNAsolidTM試劑中的組織經(jīng)平衡一段時(shí)間后，可從溶液中取出，切成更小的組織塊，再重新放回RNAsolidTM試劑中；有些比較弱的液體滲透性組織如骨頭等，不適合用RNAsolidTM試劑進(jìn)行RNA保護(hù)。）

b.植物組織：新鮮的葉、果肉、種子最少100 mg。將嫩葉，嫩莖組織切成合適的大小（建議長(zhǎng)寬高均不大于0.5 cm）后，然后迅速浸泡于5～10倍體積的RNAsolidTM試劑中。（注意：某些植物組織天生具有的屏障，如葉子表面的蠟層可阻礙RNAsolidTM試劑的滲透，對(duì)于此類(lèi)組織，通常需破壞這些屏障層以允許溶液的浸透。）

c.細(xì)胞等樣本：收集不小于10^6個(gè)細(xì)胞的沉淀（用PBS清洗1-2次）。之后迅速加入5～10倍體積的RNAsolidTM試劑。

d.酵母、細(xì)菌等樣本：離心棄上清，收集小米粒大小的單菌體沉淀，然后迅速加入適量的RNAsolidTM試劑浸沒(méi)菌體沉淀。

e. RNA樣品： OD260/280為1.8-2.0，濃度≥100 ng/μL，體積≥20μL，干冰運(yùn)輸。

f.cDNA：cDNA原液≥20 μL，干冰運(yùn)輸。

2. 樣品保存及運(yùn)輸

加入有RNAsolidTM試劑的樣本可在37℃保存1～2天，2天以后部分組織中的RNA會(huì)開(kāi)始降解。室溫（25℃）穩(wěn)定保存1周，不會(huì)有明顯的RNA降解發(fā)生。大部分樣品置于RNAsolidTM試劑中，4℃條件下可穩(wěn)定保存1個(gè)月，不會(huì)有明顯的RNA降解發(fā)生。長(zhǎng)期存放可先將保存在RNAsolidTM試劑中的樣本4℃浸透過(guò)夜，然后將RNAsolidTM試劑吸出棄去，再將樣本放入-20℃或-80℃長(zhǎng)期穩(wěn)定保存3～5年。

關(guān)于Real-time qPCR如何進(jìn)行數(shù)據(jù)分析

1. Real-time qPCR常見(jiàn)參數(shù)

基線（baseline）

通常是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)

同一次反應(yīng)中針對(duì)不同的基因需單獨(dú)設(shè)置基線

閾值（threshold）

自動(dòng)設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍

手動(dòng)設(shè)置：置于指數(shù)擴(kuò)增期，剛好可以清楚地看到熒光信號(hào)明顯增強(qiáng)

同一次反應(yīng)中針對(duì)不同的基因可單獨(dú)設(shè)置閾值，但對(duì)于同一個(gè)基因擴(kuò)增一定要用同一個(gè)閾值。

Ct值:與起始濃度的對(duì)數(shù)成線性關(guān)系。

分析定量時(shí)候一般取Ct:15-35。太大或者太小都會(huì)導(dǎo)致定量的不準(zhǔn)確。

Rn（Normalized reporter）是熒光報(bào)告基團(tuán)的熒光發(fā)射強(qiáng)度與參比染料的熒光發(fā)射強(qiáng)度的比值。
△Rn：△Rn是Rn扣除基線后得到的標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)果（△Rn=Rn-基線）。

2. 影響Ct值的關(guān)鍵因素

模板濃度

模板濃度是決定Ct的最主要因素?？刂圃谝粋€(gè)合適范圍內(nèi)，使Ct在15-35之間

反應(yīng)液成分的影響

任何分子的熒光發(fā)射都受環(huán)境因素影響----比如溶液的pH值和鹽濃度。

PCR反應(yīng)的效率

PCR反應(yīng)的效率也會(huì)影響Ct值。在PCR擴(kuò)增效率低的條件下進(jìn)行連續(xù)梯度稀釋擴(kuò)增，與PCR擴(kuò)增效率高的條件下相比，可能會(huì)所產(chǎn)生斜率不同的標(biāo)準(zhǔn)曲線。PCR效率取決于實(shí)驗(yàn)、反應(yīng)混合液性能和樣品質(zhì)量。一般說(shuō)來(lái)，反應(yīng)效率在90-110%之間都是可以接受的。

3. 如何評(píng)估實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)的效果

PCR擴(kuò)增效率：為了正確地評(píng)估PCR擴(kuò)增效率，至少需要做3次平行重復(fù)，至少做5個(gè)數(shù)量級(jí)倍數(shù)(5logs)連續(xù)梯度稀釋模板濃度。

另一個(gè)評(píng)估PCR效率的關(guān)鍵參數(shù)是相關(guān)系數(shù)R2，它是說(shuō)明兩個(gè)數(shù)值之間相關(guān)程度的統(tǒng)計(jì)學(xué)術(shù)語(yǔ)。如果R2等于1，那么你可以用Y值（Ct）來(lái)準(zhǔn)確預(yù)測(cè)X值（量）。如果R2等于0，你就不能通過(guò)Y值來(lái)預(yù)測(cè)X值。R2值大于0.99 時(shí)，兩個(gè)數(shù)值之間相關(guān)的可信度很好。

標(biāo)準(zhǔn)偏差（standard deviation，偏差的平方根）是的精確度計(jì)量方法。

如果許多數(shù)據(jù)點(diǎn)都靠近平均值，那么標(biāo)準(zhǔn)偏差就小；如果許多數(shù)據(jù)點(diǎn)都遠(yuǎn)離平均值，則標(biāo)準(zhǔn)偏差就大。實(shí)際上，足夠多重復(fù)次數(shù)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)組會(huì)形成大致的正態(tài)分布。這經(jīng)常可通過(guò)經(jīng)典的中心極限理論來(lái)證明，獨(dú)立同分布隨機(jī)變量在無(wú)限多時(shí)趨向于正態(tài)分布。如果PCR反應(yīng)效率是 100%，那么2倍稀釋點(diǎn)之間的平均Ct間隔應(yīng)該恰為1個(gè)Ct值。要以99.7%的幾率分辨2倍稀釋濃度，標(biāo)準(zhǔn)偏差就必須小于等于0.167。標(biāo)準(zhǔn)偏差越大，分辨2倍稀釋的能力就越低。為了能夠在95%以上的情況下分辨出2倍稀釋?zhuān)瑯?biāo)準(zhǔn)偏差必須小于等于 0.250

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