1.制備含MMP底物蛋白的SDS-PAGE凝膠：推薦分離膠濃度為8%。按照標(biāo)準(zhǔn)程序制備SDSPAGE凝膠。將10×substrateG融化，并90ºC加熱5分鐘。分別在濃縮膠和分離膠中額外加入10×substrateG并使之稀釋10倍，混勻后加入過(guò)硫酸銨和TEMED，等待凝膠聚合。
2.待測(cè)樣品1:1稀釋于2×SDS-PAGEnon-reducingbuffer（用完后可自行配制：4%SDS,100mMTris-ClpH6.8,20%glycerol,0.02%bromophnolblue），混合后直接上樣。切勿加熱變性，并且僅使用不加還原劑的上樣緩沖液?？赏ㄟ^(guò)預(yù)試驗(yàn)確定加樣量，使用普通蛋白預(yù)染Marker即可。陽(yáng)性對(duì)照（可選步驟）：可取人、小鼠、大鼠或兔100μl全血與100μl2×SDS-PAGEnonreducingbuffer等體積混合，取5-15μl上樣。
3.低電流恒流電泳，每一塊小膠電流為20mA/gel。溴酚藍(lán)跑出凝膠前沿時(shí)結(jié)束電泳。
4.洗滌凝膠：取出凝膠，去除濃縮膠，放入容器內(nèi)?？上扔眠m量蒸餾水沖洗凝膠，然后加入10ml1×BufferA（用蒸餾水稀釋），室溫漂洗凝膠2×30分鐘。中間換液。
5.孵育：倒掉BufferA。加入10ml1×BufferB（蒸餾水稀釋），室溫或37ºC孵育1~5小時(shí)。陽(yáng)性對(duì)照或者血中的MMP通常37ºC孵育1小時(shí)即可顯示。如MMP活性低，應(yīng)延長(zhǎng)孵育時(shí)間為10小時(shí)或過(guò)夜。
6.顯色：倒掉BufferB，加入SDS-PAGE凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液（操作步驟見(jiàn)SDS-PAGE凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液說(shuō)明書(shū)）。凝膠的大部分區(qū)域被深染，在有MMP條帶的位置不被染色而形成透亮區(qū)域。透明區(qū)域的位置和范圍指示MMP-2、MMP-9的大小位置（酶譜）及活性。陽(yáng)性對(duì)照將在66~72（MMP-2）、92（MMP-9）、130（proMMP-9）、225（proMMP-9）kDa
位置出現(xiàn)透明條帶。
7.條帶掃描：將凝膠放在掃描儀上掃描。雖然MMP條帶透明，但凝膠背景并非真正全黑。解決辦法：可用非透射光掃描，或用軟件圖像處理程序調(diào)整背景顯示為灰度顯示，并盡量設(shè)置為黑色。MMP條帶則為白色，這種背景黑條帶白的格式是英文論文中zui常見(jiàn)的格式。
您的位置：
更新時(shí)間：2015-05-20 
瀏覽次數(shù)：1631
