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產(chǎn)品分類信帆生物為大家分享:RNA提取注意事項(xiàng)
RNA提取注意事項(xiàng)
一些RNA提取方法,在進(jìn)行具體實(shí)驗(yàn)時(shí),應(yīng)根據(jù)研究對(duì)象的性質(zhì),提取核酸的用途而對(duì)上述方法在操作步驟和試劑使用量上作一定的修改。
1、 在核酸提取時(shí),為了增加細(xì)胞的裂解度,增加核蛋白復(fù)合體破碎度,以釋放更多的游離核酸,在操作中常要用到溶菌酶和蛋白酶k,在確保沒有核酸水解酶存在的前提下,酶反應(yīng)時(shí)間越長越好。
2、有時(shí)在使用蛋白酶時(shí),為了抑制核酸水解酶的降解作用,可在蛋白酶緩沖液中用終濃度5mM的EDTA代替NaCL,并且可將反應(yīng)溫度提高到50-60℃,并將反應(yīng)時(shí)間縮短到15-25min,但酶用量必須提高10-20倍。溶菌酶使用時(shí)緩沖液中需加EDTA,因游離金屬離子對(duì)酶有抑制。
3、許多植物材料中富含酚,在細(xì)胞破碎時(shí),在多酚氧化酶作用下,被氧化成有色的錕類物資,影響核酸的提取及降低提取質(zhì)量,在提取液中加入PVP和巰基乙醇對(duì)降低酚類的干撓可能有所幫助。PVP將與酚形成復(fù)雜的聚合體,在提取時(shí)將酚從核酸成分中游離。且PVP與巰基乙醇作為強(qiáng)還原劑可防止多酚的褐變。另外作為還原劑的這些成分在一定程度上可抑制核酸水解酶的作用。
4、 許多生物材料在提取核酸時(shí),都會(huì)遇到多糖的污染問題,具體表現(xiàn)為有機(jī)溶劑沉淀時(shí),沉淀很多,但復(fù)溶時(shí),大量沉淀不溶,電泳觀察時(shí)核酸含量很低。
克服多糖污染可采用以下一些辦法
1) CTAB多次抽提。
2) 在有機(jī)溶劑沉淀時(shí)先稀釋樣品濃度(可到10倍左右),對(duì)低濃度樣品再進(jìn)行沉淀。
3)在有機(jī)溶劑沉淀時(shí)選用異丙醇和5MNaCL作為沉淀溶劑,此時(shí)氯化鈉的用量可用到1/5-1/2的體積,異丙醇可用到0.6-1的體積。異丙醇沉淀核酸時(shí),高濃度鹽存在將使大量多糖存在在溶液中,從而可達(dá)到去多糖的作用。但高濃度的鹽存在會(huì)影響核酸的進(jìn)一步操作,因此必須用乙醇多次洗滌脫鹽。
5、在核酸提取時(shí),酚與氯仿均起到變性的作用。酚的變性能力強(qiáng)于氯仿,但酚與水有一定的互溶,因此酚抽后,除可能損失部分核酸外,水相中還會(huì)殘留酚,而酚的存在將對(duì)核酸的酶反應(yīng)產(chǎn)生強(qiáng)的抑制,因此在操作中可單用氯仿作變性劑、也可用酚/氯仿混合變性,也可用單一酚作變性己,但用單一酚后在有機(jī)溶劑沉淀時(shí)一定要用氯仿從抽提。
6、 在操作中當(dāng)加入變性劑氯仿后,為了保證核酸樣品的完整性,操作要輕,尤其在提DNA時(shí),更要避免劇烈操作。
7、 在沉淀核酸時(shí)可用乙醇與異丙醇,乙醇的極性要強(qiáng)于異丙醇,所以一般用2V乙醇沉淀,但在多糖、蛋白含量高時(shí),用異丙醇沉淀可部分克服這種污染,尤其用異丙醇在室溫下沉淀對(duì)擺脫多糖、雜蛋白污染更為有效。
8、 在提取核酸時(shí),如樣品濃度低,則應(yīng)增加有機(jī)溶劑沉淀時(shí)間,-70℃下>30min;-20℃過一夜將有助于增加核酸的沉淀量。
9、 在核酸提取過程中有機(jī)溶劑沉淀后復(fù)溶時(shí)可加水因此時(shí)離子濃度可能較高,而到高度純化后低溫保存時(shí)復(fù)溶于TE緩沖液中,因溶于TE的核酸儲(chǔ)藏穩(wěn)定性要高于水溶液中的核酸。另外核酸樣品保存時(shí)要求以高濃度保存,低濃度的核酸樣品要比高濃度的更易降解。
10、 核酸提取后可通過PCR 、RT-PCR直接擴(kuò)增出目的基因片斷,也可首先構(gòu)建文庫、然后由RACE、dd-PCR等差異顯示技術(shù)、AFLP等標(biāo)記技術(shù)、差異雜交或文庫扣除技術(shù)等方法篩選出特異探針,再用此探針從文庫中篩選出完整基因。
11、 在抽提過程中,若蛋白質(zhì)含量或其它的雜質(zhì)還較多,可以增加抽提次數(shù).提取RNA請(qǐng)盡量在低溫下操作,如果條件不容許,在室溫下操作的時(shí)間要盡可能的短。
信帆生物為大家分享:RNA提取注意事項(xiàng)
針對(duì)酶的一些注意事項(xiàng)
防止RNA酶污染的措施:
1、 所有的玻璃器皿均應(yīng)在使用前于180℃的高溫下干烤6hr或更長時(shí)間。
2、 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿沖洗(注意:有機(jī)玻璃器具因可被氯仿腐蝕,故不能使用)。
3、 有機(jī)玻璃的電泳槽等,可先用去污劑洗滌,雙蒸水沖洗,乙醇干燥,再浸泡在3% H2O2 室溫10min,然后用0.1% DEPC水沖洗,晾干。
4、 配制的溶液應(yīng)盡可能的用0.1% DEPC,在37℃處理12hr以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑,應(yīng)當(dāng)用DEPC處理過的無菌雙蒸水配制,然后經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌。
5、 操作人員戴一次性口罩、帽子、手套,實(shí)驗(yàn)過程中手套要勤換。
6、 設(shè)置RNA操作實(shí)驗(yàn)室,所有器械等應(yīng)為。
7、 DEPC能與胺和巰基反應(yīng),因而 含Tris和DTT的試劑不能用DEPC處理
8、 加樣原則是DNAzui后加,其他試劑按照體積大小從大往小的加。如果是同種引物和探針有多管的話只是DNA不同,那么采取的方法是算出總體積后加在一個(gè)管子里面,混合均勻之后再分裝到各個(gè)管子里去,這樣可以有效地避免誤差及污染。
9、 普通實(shí)驗(yàn)室容易污染,且污染程度很高,與跑電泳還有質(zhì)粒制備提取都在同一個(gè)房間里有比較大的關(guān)系,zui容易造成高濃度污染的就是產(chǎn)物的開蓋和質(zhì)粒的稀釋。因此要格外注意一些。
常用的RNA酶抑制劑:
1、 焦磷酸二乙酯(DEPC):是一種強(qiáng)烈但不*的RNA酶抑制劑。它通過和RNA酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性,從而抑制酶的活性。
2、 異硫氰酸胍:目前被認(rèn)為是zui有效的RNA酶抑制劑,它在裂解組織的同時(shí)也使RNA酶失活。它既可破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)使核酸從核蛋白中解離出來,又對(duì)RNA酶有強(qiáng)烈的變性作用。
3、 氧釩核糖核苷復(fù)合物:由氧化釩離子和核苷形成的復(fù)合物,它和RNA酶結(jié)合形成過渡態(tài)類物質(zhì),幾乎能*抑制RNA酶的活性。
4、 RNA酶的蛋白抑制劑(RNasin):從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競爭性抑制劑,可以和多種RNA酶結(jié)合,使其失活。
5、其它:SDS、尿素、硅藻土等對(duì)RNA酶也有一定抑制作用。因?yàn)镈EPc不加選擇的修飾蛋白質(zhì)和RNA,因此在分離和純化RNA過程中不能使用,而且它與一些緩沖液(例如Tri)不能相容在所有RNA實(shí)驗(yàn)中,zui關(guān)鍵的因素是分離得到全長的RNA。而實(shí)驗(yàn)失敗的主要原因是核糖核酸酶(RNA酶)的污染。
附確認(rèn)RNA溶液中有沒有殘留的RNA酶的方法:
按照樣品濃度,從RNA溶液中吸取兩份1000 ng的RNA加入至0.5 ml的離心管中,并且用pH7.0的Tris緩沖液補(bǔ)充到10ul的總體積,然后密閉管蓋。把其中一份放入70℃的恒溫水浴中,保溫1 h。另一份放置在-20℃冰箱中保存1h。取出兩份樣本進(jìn)行電泳。電泳完成后,比較兩者的電泳條帶。如果兩者的條帶一致或者無明顯差別,則說明RNA溶液中沒有殘留的RNA酶污染,RNA的質(zhì)量很好。相反的,如果70℃保溫的樣本有明顯的降解,則說明RNA溶液中有RNA酶污染。
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